PLoSOne
Jul9
IF：2.
Introduction
高级别胶质瘤，特别是多形性胶质母细胞瘤（GBM）是原发性脑肿瘤中最常见、最具侵袭性的类型，占原发性脑肿瘤的52%。缺氧在干细胞的正常内环境稳定以及胶质瘤的发生、发展和侵袭性中起着关键作用，这支持了一种特殊的肿瘤微环境的概念，在这种环境中，缺氧对于招募肿瘤干细胞样细胞、解除其分化的调控至关重要。近年来，BMPs治疗被认为是一种很有前途的治疗脑癌的方法，以减少肿瘤细胞的生长。事实上，BMP4和类似的BMP2治疗在体外促进GBM衍生细胞的细胞周期阻滞和胶质细胞分化。在最近的一项研究中，我们证明缺氧可通过下调肿瘤细胞内内源性BMP信号，特别是smad1/5/8的激活，将GBM来源的细胞保存在增殖性更强、细胞更不稳定的阶段，这为HIF-1α在缺氧条件下可能反作用BMP信号的激活提供了证据。缺氧作为正常细胞和肿瘤细胞生长调节因子的迹象也来自其他研究，其中缺氧已被证明可诱导颈动脉体生长和产生新的神经嵴衍生的血管球细胞，同时还涉及多种信号通路的调节，如notch信号。此外，HIF-1α的表达似乎依赖于哺乳动物雷帕霉素（mTOR）的转录和翻译调控。此外，在高密度培养的小鼠CNS前体细胞中，mTOR信号通路似乎也被BMP激活；mTOR激活介导的可能效应之一是Stat3的丝氨酸磷酸化，最终导致胶质细胞的产生。总之，这些数据表明BMP与mTOR在控制胶质细胞分化和HIF-1α转录活性方面是一致的。在这里，我们研究了mTOR信号在缺氧（2%氧气）条件下维持的原代GBM来源细胞HIF-1α稳定性调节中的作用，类似于其生理微环境的条件，评估了急性氧张力升高和BMP2处理介导的效应。我们的结果表明，缺氧维持mTOR通路处于非活性状态，这是通过保持HIF-1α的稳定性来实现的，而急性暴露于高氧张力和/或BMP2处理促进了Akt/mTOR的激活和GBM细胞中下游依赖的翻译前和分化前反应，在这些刺激下，琥珀酸脱氢酶（SDH）活性增加，表明其发生代谢改变。在这里，我们描述了发生在正常和肿瘤细胞的分子机制后，高氧紧张急性暴露和BMP2治疗。
Methodology
1.隔离和气体控制的细胞扩增
2.蛋白质印迹和光密度分析
3.实时PCR分析
4.HRE荧光素酶报告基因检测
5.使用慢病*载体转导GBM细胞
6.琥珀酸脱氢酶活性
7.乳酸测定
8.COX活性分析
9.统计分析
Results
急性暴露于高氧压下以时间依赖性方式促进GBM衍生细胞中的Akt/mTOR活化
先前已显示BMP2在缺乏血清的2T3细胞中增加Akt丝氨酸/苏氨酸激酶活性，并且已知Akt/PKB信号激活mTOR途径。重要的是，我们最近证明，在GBM衍生的细胞中，增加的氧张力通过SMAD1/5/8激活诱导内源性BMP途径的激活。我们试图研究在低氧（2％氧气）下不断维持的GBM细胞对急性20％氧气张力的时间依赖性暴露是否正在促进Akt/mTOR信号通路激活。我们观察到在高氧气暴露后，时间依赖性的苏氨酸激活了Akt，而丝氨酸则没有激活（数据未显示）（图1A，C）。另外，高氧暴露会诱导丝氨酸水平的mTOR磷酸化（图1A，D）。在持续的缺氧条件下，这些激活被抑制。已知mTOR可调节几种生物细胞反应，其中包括：i）通过激活p70S6-激酶（p70S6K）和抑制抑制剂4eBP1进行翻译，ii）通过充当细胞周期调节剂来促进细胞增殖，iii）细胞存活Stat3激活和细胞分化；iv）通过激活HIF-1α和血管内皮生长因子（VEGF）进行血管生成。我们发现，所有mTOR下游靶标均被急性高氧暴露以时间依赖性方式激活。总的Akt/mTOR蛋白分析表明，GBM和逐渐暴露于高氧压下的正常细胞中的条件均表达均匀（图1A，B）。特别是，Stat3（Ser）在高氧暴露30分钟后被激活（图1A，E），这表明神经胶质发生和/或促成生存应答的激活。此外，虽然4eBP1仅被氧气适度抑制（数据未显示），这可能是由于参与4eBP1调控的其他调控途径所致，但p70S6K（Thr）却被高度上调，尤其是在分钟后（图1A，F）。这些结果表明，对Akt/mTOR依赖的促翻译途径（p70S6K）的激活以及神经胶质形成和促生存机制（Stat3）响应于急性高氧暴露而发生。而且，翻译的增加似乎是针对细胞分化的，正如我们先前报道的，p21cip1的增加和内源性BMP依赖的星形胶质细胞的增加所表明的那样。在正常的SVZ来源的细胞中，Akt仅适度地被氧暴露而未被显着活化，而mTOR活化在1小时后发生。尽管mTOR磷酸化后未激活mTOR下游靶标Stat3和p70S6k（图1B–F）。这些结果表明正常和肿瘤细胞对高氧张力暴露的反应有所不同。受mTOR控制的另一种蛋白是HIF-1α。我们发现在GBM和正常SVZ细胞中，急性高氧暴露都能快速降解HIF-1α（图2A–C）。尽管在高氧暴露2小时后，GBM细胞中可见HIF-1α蛋白的适度恢复，但在正常细胞中则没有（图2A–C），表明肿瘤细胞可能通过缺氧独立机制（可能受mTOR进行性激活控制）重新建立了HIF-1α水平。我们还分析了REDD1（RTP），它已被证明在缺氧条件下以HIF-1α依赖的方式强烈诱导，最近的研究也表明REDD1在TSC1/TSC2介导的mTOR抑制中发挥作用。因此，我们发现在急性高氧暴露后，GBM细胞中REDD1的表达下调，而正常SVZ细胞中的REDD1的表达降低（图2A，B，D）。因此，HIF-1α/REDD1下调后，可能会发生高氧依赖性的Akt/mTOR信号激活。
需要HIF-1α来抑制缺氧肿瘤细胞中Akt/mTOR信号的激活
为了了解HIF-1α是否介导低氧对Akt/mTOR信号传导的抑制作用，我们使用含有siHIF-1α的慢病*载体以及增强的绿色荧光蛋白作为转导效率的指标（siHIF-1α-EGFP）沉默HIF-1α（图3A，D），与作为阴性对照的siLuciferase-EGFP载体（siLUC-EGFP）进行比较（未显示）。正如我们之前的研究中已经报道的那样，通过沉默GBM细胞中的HIF-1α，1周后细胞发生强烈分化并最终死亡，而siLUC-EGFP没有观察到这些作用。重要的是，与对照组和用siLUC-EGFP载体转导的GBM细胞相比，即使在2%氧气下培养的HIF-1α沉默细胞中，Akt、mTOR、Stat3和p70S6K也被激活（图3B，C）。在正常SVZ细胞中，HIF-1α沉默没有引起任何显著的影响，最终与对照组相比，Akt和mTOR受到抑制（图3E，F）。HIF-1α沉默与GBM细胞中更强的BMP途径活性相关，如SMAD1/5/8磷酸化所示，已知BMP途径激活Akt，并与Stat3调节促进星形胶质细胞生成相关。这些结果表明，缺氧肿瘤细胞中的HIF-1α可能需要抑制趋化信号（SMAD1/5/8和Stat3）来促进星形胶质细胞的命运。为了证明HIF-1α下调是引起高氧依赖性Akt/mTOR活化所必需的，我们使用氯化钴（CoCl2，μM）稳定HIF-1α，其模拟缺氧对HIF-1α的影响，并且12小时后我们将细胞暴露于高氧张力。考虑到HIF-1α沉默后细胞的存活率很低，直接在HIF-1α沉默细胞上进行这些实验是不可行的。我们发现，通过化学稳定HIF-1α，REDD1上调，并且在暴露于高氧张力下的GBM衍生细胞中Akt/mTOR途径保持被抑制（图3G），只有p70S6K激活确实发生，这可能取决于p70S6K激活的效应子替代mTOR。重要的是，正常SVZ细胞的反应方式不同；事实上，通过化学稳定HIF-1α，REDD1在暴露于高氧张力下后短暂上调，并且与肿瘤细胞不同，Akt/mTOR途径不受抑制（图3H），并且Akt和Stat3最终被CoCl2上调。这些结果表明HIF-1α的稳定，可能通过REDD1，阻止高氧诱导的Akt/mTOR活化，这似乎更具体地发生在GBM来源的细胞中。
外源BMP2类似于高氧暴露，可促进Akt/mTOR途径激活，这取决于HIF-1α/REDD1下调
我们试图调查是否像急性高氧暴露一样，外源性BMP2是否会影响Akt/mTOR途径的激活。BMP2处理后，总的Akt/mTOR信号转导蛋白在GBM和正常细胞中均均表达（图4A），我们发现Akt（Thr）和mTOR（Ser）的激活都随着时间而发生（图4A，C，D），重要的是，在急性高氧暴露下，这种活化作用得以加速和改善，即使长期暴露于BMP2（72小时）后仍保持高度活化作用（图4B）。重要的是，在低氧条件下，短时治疗后Akt和mTOR被抑制，在BMP2刺激72小时后被激活。在正常的SVZ细胞中，我们发现Akt和mTOR仅通过添加BMP2进行瞬时调节，并且在72小时后这些激活导致下调（数据未显示）。对mTOR下游靶标的分析显示，BMP2处理后Stat3（Ser）和p70S6K（Thr）激活随时间的增加，并且通过维持细胞在低氧状态下这些作用得以减慢和减弱（图4A，E，F），并且在正常细胞中也短暂发生。还发现B21上调了参与细胞周期阻滞和诱导分化的p21cip1，但缺氧抑制了该作用（数据未显示）。已知HIF-1α的表达受mTOR控制，mTOR抑制剂REDD1被HIF-1α转录激活。我们分析了在进行BMP2治疗后HIF-1α蛋白是否受到了影响，我们发现即使在缺氧的情况下，GBM细胞中BMP2刺激15分钟后，HIF-1α也会被强烈下调（图5A，B）。重要的是，HIF-1α水平在分钟后恢复，但是当GBM细胞也急性暴露于高氧时则无法恢复。此后的稳定化可能与BMP2介导的mTOR信号激活有关（图4A，B）。根据我们最近的工作，在更长的BMP2暴露时间（72小时）后HIF-1α水平降低（未显示），这很可能与GBM细胞中依赖BMP2的神经胶质细胞分化有关。相反，HIF-1α表达的维持似乎与肿瘤细胞的去分化和正常细胞的原始性有关。在正常的SVZ来源的细胞中，BMP2刺激后HIF-1α瞬时下调，并随时间恢复，但长期（72小时）处理后其表达未改变（数据未显示）。重要的是，在缺氧情况下，REDP1也被BMP2下调（图5A，C），而这只是在正常细胞中短暂发生。这表明，类似于急性高氧暴露，BMP2可能通过下调抑制性REDD1促进mTOR活化。由于REDD1被HIF-1α转录激活，因此我们研究了BMP2是否通过使用缺氧反应元件（HRE）-荧光素酶报告基因构建物，除了调节HIF-1α蛋白外，还促进了对HIF-1α转录活性的抑制。尽管生理性肿瘤样品具有可变性，但与未处理的细胞相比，在BMP2处理8小时后，我们发现缺氧条件下HIF-1α转录活性降低了40％。相反，在正常的SVZ细胞中，BMP2以相反的方式运行，促进了HIF-1α活性增加了近10％（图5D），指出正常细胞与肿瘤细胞在BMP2反应性方面的差异。我们还测试了雷帕霉素单独治疗还是与BMP2结合治疗，以评估阻断mTOR下游信号传导是否也影响HIF-1α稳定性。我们发现，根据报道的结果，雷帕霉素治疗72小时不影响HIF-1α转录激活（数据未显示），诱导的HIF-1α蛋白还原作用不太明显，而与BMP2联合使用时，这些作用没有进一步改善（图5E）。正常的SVZ电池以类似的方式响应（数据未显示）。为了证明Akt/mTOR激活是由于BMP2抑制了HIF-1α/REDD1，我们对CoCl2预处理的GBM细胞进行了BMP2处理。我们发现，通过稳定HIF-1α并因此也稳定REDD1，BMP2治疗后Akt/mTOR信号未激活（图6A）。最近发生了p70S6K激活，可能是由于p70S6K激活的效应物替代了mTOR，如上所述，并且Stat3（S）最终在CoCl2处理的细胞中更稳定地表达，尽管在这段时间内它并未被BMP2调节（图6A）。重要的是，在正常的SVZ细胞中，化学上的HIF-1α稳定仅短暂地诱导REDD1上调，而与BMP2处理后的肿瘤细胞不同，Akt/mTOR通路没有被抑制，并且最终上调了Akt和Stat3。除了使用CoCl2之外，我们还使用了在低氧条件下BMP2时间处理8或24小时之前30分钟添加的蛋白酶体抑制剂Z-LLF-CHO（Z-LLF，30μM）。通过防止蛋白酶体降解，BMP2不会影响HIF-1α蛋白质的稳定性（图6B）。此外，缺氧的BMP2治疗后，REDD1上调且Akt/mTOR信号未激活（图6B）。这些结果证实，在依赖于BMP2的Akt/mTOR激活中，需要HIF-1α降解以及因此REDD1下调，并且这优先发生在GBM细胞中。
外源BMP2甚至通过缺氧调节FKBP38促进PHD2蛋白水平的增加
当我们看到BMP2处理后HIF-1α蛋白的稳定性受到影响时，我们研究了参与HIF-1α脯氨酸羟基化和相应蛋白酶体降解的脯氨酸羟化酶（PHD）是否受BMP2调控。PHD2尤其被描述为在常氧条件下设置HIF-1α低稳态水平的临界氧传感器。在同一项研究中，PHD2被缺氧上调，提供了一种由氧张力本身驱动的HIF-1依赖的自我调节机制。我们发现，在GBM（图7A，C）和正常SVZ细胞中，PHD2蛋白被BMP2快速上调，并且在缺氧条件下发生得更慢。另外，经过长时间的BMP2处理后，PHD2蛋白在GBM细胞中表达上调（图7B），这与我们之前的研究一致。QRT-PCR显示，尽管缺氧条件下PHD2转录物上调，但根据文献，72小时的BMP2治疗诱导了适度但不显著的PHD2mRNA减少（图7D）。在BMP2处理的正常SVZ细胞中也记录到PHD2转录物减少。值得注意的是，PHD2启动子的特征是存在由HIF-1α直接控制的HRE共有序列。因此，我们假设观察到的PHD2mRNA减少可能依赖于BMP2诱导的HIF-1α转录抑制，如前所述（图5D）。继我们观察到BMP2介导的PHD2蛋白增加不依赖于从头蛋白质合成（图7D）之后，我们试图研究BMP2是否以某种方式增加PHD2蛋白的稳定性。肽基脯氨酰顺/反异构酶FK结合蛋白38（FKBP38）被描述为通过靶向PHD2来降解蛋白酶体的PHD2蛋白调节剂[19]。我们发现FKBP38在缺氧条件下被BMP2逐渐下调（图7A，E），并且在延长BMP2治疗后也观察到这种效应（图7B）。与文献[19]所述相反，我们还发现FKBP38在缺氧性GBM细胞中上调，表明它可能通过促进PHD2降解参与缺氧性HIF-1α的稳定性。QRT-PCR分析证实FKBP38在急性高氧暴露和缺氧条件下BMP2的转录水平下调（图7F）。相反，在正常SVZ衍生细胞中，BMP2处理结合高氧暴露诱导FKBP38上调，也在蛋白质水平没有发生这种情况。因此，我们假设BMP2可能通过下调GBM细胞中FKBP38的表达来促进PHD2的稳定。
外源BMP2，通过减少细胞内琥珀酸，增加PHD2活性，导致HIF-1α调节
我们最后试图研究BMP2治疗是否增加了PHD2的活性从而引起HIF-1α的调节。先前已有报道，几种癌症类型中SDH活性受损与HIF-1α稳定相关，其机制涉及胞浆内琥珀酸积累和相应的PHD2抑制。事实上，SDH是结合到线粒体内膜的酶复合物II，通过FAD还原为FADH2将琥珀酸转化为富马酸。重要的是，在其他细胞模型中也发现，BMPs诱导分化可增加线粒体氧化磷酸化，如SDH活性升高所见。我们发现BMP2处理诱导GBM细胞中SDH活性的增加（图8A，B）。这表明促分化剂，如BMPs，可能促进肿瘤细胞向氧化磷酸化的代谢转移，BMP2通过诱导SHD活化减少细胞内琥珀酸，可能增加PHD2活性，导致HIF-1α的调节。值得注意的是，在正常SVZ细胞中，BMP2处理后SDH激活没有改变，这表明正常细胞和肿瘤细胞对BMP2处理的代谢反应存在差异。在存在或不存在BMP2的情况下进一步添加外源性酯化琥珀酸二乙酯（5mM，Sigma）不会诱导SDH活化（未显示）。我们还测试了额外的琥珀酸盐与BMP2联合是否促进了HIF-1α蛋白水平的恢复和/或确定了对GBM细胞中Akt/mTOR信号的抑制。我们发现在BMP2/琥珀酸盐处理的细胞中，HIF-1α、REDD1和FKBP38蛋白表达上调，即使暴露在20%的氧气中。此外，尤其是与仅经BMP2处理的细胞相比，在联合使用BMP2和琥珀酸盐的情况下，Akt和p70S6K的激活适度降低（图8C）。这表明额外的琥珀酸通过上调HIF-1α和REDD1，部分抑制BMP2治疗后Akt/mTOR的激活。???????????
Conclusion
总之，我们描述了BMP2以及类似地通过激活Akt/mTOR信号，抑制FKBP38并诱导SDH活性来调节GBM细胞中HIF-1α稳定性并因此诱导REDD1转录的机制。保留缺氧的生态位可共同抑制这些影响。此外，我们的研究结果表明，GBM细胞与正常细胞之间在高氧和BMP2敏感性方面存在离散差异，应利用它们更好地定义肿瘤细胞生物学。
Reference:MolecularMechanismsofHIF-1αModulationInducedbyOxygenTensionandBMP2inGlioblastomaDerivedCells
PMID
/p>
dio:10./journal.pone.
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