大家好，今天要分享的是年2月发表在Cell（IF:38.）上的文章，题为InhibitoryCDreceptoridentifiedinglioma-infiltratingTcellsbysingle-cellanalysis。
单细胞分析鉴定胶质母细胞瘤T细胞中的CD抑制受体
简述
胶质瘤患者肿瘤浸润性T细胞的单细胞分析确定了细胞*性程序和自然杀伤细胞NK受体共表达的T细胞群。
克隆的肿瘤浸润T细胞分析进一步确定了NK细胞受体基因——杀伤细胞凝集素样受体B1（KillerCellLectinLikeReceptorB1，KLRB1）(编码CD)作为候选抑制靶点。因此，KLRB1的表达失活或抗体介导的CD阻断增强了T细胞介导的体外杀伤胶质瘤细胞及其体内抗肿瘤功能。KLRB1及其相关的转录程序也在其他人类癌症的大量T细胞群中表达。该研究提供了胶质瘤浸润T细胞的图谱，并强调KLRB1转录程序是泛癌免疫治疗的靶点。（免疫微环境-差异分析-功能富集-湿实验验证/临床意义-泛癌免疫疗法）
Results
1.胶质瘤浸润性T细胞群的单细胞图谱
GBM和IDH-G在浸润性T细胞亚群中具有相似的组成，但GBM中T细胞的总丰度及其细胞*性程序更高。
选取16例IDH野生型胶质瘤（GBM组）和15例IDH突变型胶质瘤（IDH-G组，受2-HG的免疫抑制影响）患者样本。其中地塞米松（dexamethasone，一种皮质类固醇）治疗与浸润性T细胞数量显著减少相关(CD3+和CD4+T细胞的平均减少量分别为4.14倍和7.72倍，图1B)。
对肿瘤组织中分离出的T细胞进行全长scRNA-seq，在GBM和IDH-G中鉴定出四种主要的T细胞群：CD8T细胞、CD4常规T细胞(CD4Tconv)、CD4调节T细胞(Treg)和循环T细胞(图1C)，且无论既往治疗或IDH突变与否，这种划分的总体特征一致(图1D和S1D-S1G)。
聚类可视化得到CD4、CD8T细胞各自的六个子细胞群，涵盖多种T细胞类型。值得注意的是，其中一个CD8T细胞簇的细胞*性相关基因表达最高，这六个CD8T细胞簇也显示NK细胞基因的表达增加，甚至一组CD4T细胞中也检测到细胞*性基因的表达(图1E和1F；表S2)，此外也存在应激等特征(图S1H)。
进一步分析GBM和IDH-G相似T细胞簇的内在状态差异。第一，反映T细胞细胞*性、干扰素和细胞应激程序的基因表达信号在GBM的CD8和CD4T细胞群的相应簇中更强（图2A和2B；表S4)；第二，T细胞特异性基因在GBM中比在IDH-G中更高表达（2-HG免疫抑制）(图S2D和S2E，结合TCGA数据库)，且标准化T细胞水平后比较得到GBM中细胞*性基因(PRF1和GZMA)的表达高于IDH-G(图S2E)。
2.胶质瘤浸润性CD8+T细胞的高细胞*性与NK样信号表达有关
利用全长scRNA-seq数据集对来自26名患者的每个T细胞的细胞*性特征(PRF1、GZMB、GZMA、GZMH、NKG7和GNLY)和NK细胞特征(KLRD1、FGFBP2、FCGR3A、S1PR5、KLRC1、KLRC3、KLRB1和KLRC2)进行了评分。细胞*性特征分数与NK细胞特征分数的高相关性在CD8T细胞中更明显(图2C-2H)。进一步划分子集，可见CD8T细胞大量表达抑制性CD受体和激活性NKG2C/CD94受体(图3A和3B)。
此外，CD8T细胞*性特征与NK细胞特征的高分数也与众所周知的共抑制受体(PDCD1，CTLA4，HAVCR2，LAG3和TIGIT)的低表达有关(图2D-2E和S2G)，而细胞*性CD4T可见最高水平的PDCD1，Tregs中TIGIT表达最高(图2G、2H和S2H)，提示了合用相关ICI免疫疗法的可能。
3.克隆性T细胞群体中基因表达差异（细胞*性）
重建TCR序列(a和/或b链)以鉴定在肿瘤抗原识别后可能扩增的克隆性T细胞。在GBM和IDH-G中不仅发现了大量克隆性T细胞(图3D，S3B和S3C)（结果还受T细胞数量限制）证明胶质瘤中T细胞的活化，还分析出四个相对非克隆T细胞有不同表达特征的主要细胞簇(图S3D)。
比对克隆与否T细胞的基因表达差异，可以发现克隆CD8T细胞具有更高的细胞*性基因(GZMB和NKG7)和NK受体(KLRB1和KLRD1)的表达，尤其是KLRBI表达具有相对稳定性，表明肿瘤反应性T细胞的细胞*性等功能（图3E）。比较KLRB1阳性和阴性的克隆T细胞群，得出：在克隆性CD8T细胞中，KLRB1+T细胞表达更高水平的细胞*性(GNLY和GZMB)和NK细胞基因(NCR3和KLRD1)(图3F和S2C；表S3)。
4.CD受体在T细胞的表达及其配体CLEC2D在恶性和髓系细胞中的表达
KLRB1编码的CD蛋白之前显示在与CLEC2D(LLT1)结合后抑制NK细胞介导的细胞*性。选择KLRB1基因进行进一步研究，因为(1)除Tregs，具有细胞*性特征的CD8T细胞和CD4效应T细胞过表达该基因；(2)它编码一种可以在治疗上调节的表面蛋白；(3)它在人胶质瘤中克隆扩增的T细胞中更高表达。假设CD受体与CLEC2D结合可以抑制T细胞群的活化。
在GBM和IDH-GscRNA-seq数据集中，CLEC2DmRNA在恶性细胞和髓系细胞中都表达。分析可排除其他类型T细胞克隆扩增并高表达KLRB1的情况，并用流式和RNA-ISH证实了大部分GBM浸润的CD8T细胞和CD4T细胞（CD3E+）为CD阳性（图4C），CD+T细胞的比例比PD-1+T细胞(图4D、4E和S4E)大得多，而CLEC2DmRNA主要在恶性细胞中表达，但也在CD45+免疫细胞中表达(图4F)。
5.CD作为肿瘤特异性T细胞的抑制性受体
使用健康外周血中CD+T细胞和患者来源的胶质瘤细胞的共培养物来研究CD-CLEC2D途径（图5A）。qPCR分析可知胶质瘤细胞表达CLEC2D基因和人类白细胞抗原HLA-A*02:01蛋白NY-ESO-1肿瘤肽，故可与识别NY-ESO-1肿瘤肽的T细胞进行共培养分析。借助CRISPR/Cas9使部分CD+T细胞的KLRB1基因失活，并将NY-ESO-1特异性TCR(1G4)引入KLRB1灭活或对照T细胞，以产生具有明确肿瘤抗原特异性的T细胞群体。与对照编辑的T细胞相比，KLRB1编辑的T细胞对胶质细胞球具有更高的细胞*性活性（图5C，5J，5K）。
用CD特异性单克隆抗体(mAb)(HP-3G10)抑制其与CLEC2D结合，发现T细胞介导的细胞*性和细胞因子分泌增强。无论编辑还是抗体阻断都体现T细胞具有较高的脱颗粒标记CDa水平)(图5F)和增加的T细胞活化标记表达，同时与患者来源或U-87MG细胞系共培养的CD8T细胞中有很小一部分对PD-1蛋白呈阳性（图5G-5I）。
6.KLRB1在肿瘤浸润性T细胞中的失活增强了其体内抗肿瘤活性
建立两种不同的人源化免疫缺陷小鼠模型来评估KLRB1基因对体内T细胞功能的影响（相对于U87MG细胞系有浸润生长的优势）。模型1在MGG细胞系植入8天后成功形成高侵袭性肿瘤（图6B），进行CART细胞（NY-ESO-1TCR，KLRB1编辑或对照组）输送（图6A），并将相似BLI信号的小鼠分配给两个实验组（图6C）。两次治疗与对照编辑的T细胞相比，KLRB1的失活导致肿瘤生长显著减慢（图6D），在不良预后上体现显著存活益处（图6E），而晚期KLRB1+T细胞共培养的流式体现MGG胶质瘤中浸润颗粒酶B+CD8T细胞的数量显著增加(图6F)。
模型2同样存活率显著提高、BLI信号降低（图6K），取治疗后第8天T细胞离体，在KLRB1编辑的CD8T细胞中，PD-1的表达显著较低(图6L)，细胞*性CD4、CD8T细胞（颗粒酶B、IL-2、TNF-a等阳性）数量增加(图6M和6N)。
此外，(1)颗粒酶B+CD8T细胞的大部分是PD-1阴性的，和(2)小百分比的CD8T细胞共表达PD-1和TIM-3抑制受体(图6G-6I)表明KLRB1失活T细胞较少衰竭。
7.泛癌性——肿瘤浸润性T细胞中的KLRB1程序
分析来自黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌和结直肠癌的已发表的scRNA-seq数据集，发现KLRB1在其他人类肿瘤类型的肿瘤浸润性T细胞中有类似的转录程序，肺癌中特别突出；与CD4Tconvand和CD8T细胞相比，KLRB1在FOXP3阳性Tregs中的表达较低，表明它可能主要抑制效应T细胞的功能(图7A)。尽管KLRB1在黑色素瘤和弥漫性胶质瘤中都有表达，它是弥漫性胶质瘤中高表达的前10个基因之一(图7B)。
KLRB1转录程序在分析的五种癌症类型中有广泛和显著的重叠(图7C和7D)，故使用这种重叠来定义CD8和CD4T细胞中的泛癌KLRB1程序（还包括KRLD1、KRLF1、TYROBP、ZTBB16和CD96）(图7E)。
总结：
基于胶质瘤浸润性T细胞表达谱的观察，发现了KLRB1的遗传失活或抗体介导的CD阻断增强了T细胞介导的胶质瘤细胞体外杀伤及其体内抗肿瘤功能，并提出了增强弥漫性胶质瘤和其他人类癌症中T细胞介导的泛癌KLRB1免疫策略。
具有不同TCR储备的肿瘤浸润性T细胞表达“自然杀伤细胞”受体的现象具有重要意义，炎症介质诱导假设有待验证。抗体介导的CLEC2D-CD途径抑制，可能通过增强不同T细胞群体的抗肿瘤功能，提供与PD-1阻断剂的协同治疗益处，但阻断的潜在副作用仍不清楚，需要在非人灵长类动物模型中进行研究。
MathewsonNathanD.,AshenbergOrr.,TiroshItay.,GritschSimon.,PerezElizabethM.,MarxSascha.,Jerby-ArnonLivnat.,Chanoch-MyersRony.,HaraToshiro.,RichmanAlyssaR.,ItoYoshinaga.,PyrdolJason.,FriedrichMirco.,SchumannKathrin.,PoitrasMichaelJ.,GokhalePrafullaC.,GonzalezCastroLNicolas.,ShoreMarniE.,HebertChristineM.,ShawBrian.,CahillHeatherL.,DrummondMatthew.,ZhangWubing.,OlawoyinOlamide.,WakimotoHiroaki.,Rozenblatt-RosenOrit.,BrastianosPriscillaK.,LiuXShirley.,JonesPamelaS.,CahillDanielP.,FroschMatthewP.,LouisDavidN.,FreemanGordonJ.,LigonKeithL.,MarsonAlexander.,ChioccaEAntonio.,ReardonDavidA.,RegevAviv.,SuvàMarioL.,WucherpfennigKaiW.().InhibitoryCDreceptoridentifiedinglioma-infiltratingTcellsbysingle-cellanalysis.Cell,undefined(undefined),undefined.doi:10./j.cell..01.
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