胶质母细胞瘤微环境中缺氧表型相关基因特征 [复制链接]

JCellMolMed

00Nov

IF:4.

胶质母细胞瘤(GBM)是一种发病率最高、致死率最高的颅内恶性肿瘤；此外，由于邻近脑实质的弥漫性浸润，不可能进行完全的神经外科手术切除。尽管有包括神经外科手术切除、放疗和化疗等的干预措施，平均中位生存期只有大约5个月，而两年和五年的存活率大约是分别为6.5%和9.7%。不同途径的免疫治疗策略均显示出良好的治疗效果。对于这些治疗，有必要探索影响GBM患者预后和免疫应答的分子标志物和候选靶点。

肿瘤微环境(TME)是肿瘤细胞生长和发展的场所，包括一系列非肿瘤细胞和分子，包括浸润和常驻的免疫细胞、血管细胞和其他胶质细胞，并含有大量的细胞因子和趋化因子。肿瘤微环境的动态变化反映了肿瘤的进化本质，涉及肿瘤免疫逃逸、肿瘤生长和转移。肿瘤的进展和治疗反应与TME的异质性显著相关，从而决定了免疫治疗计划的成功。因此，对TME及其机制的深入理解至关重要。

创新的计算方法和基因组学让我们对TME有了初步的了解。例如，CIBERSORTx、肿瘤免疫估计资源(TIMER)和使用表达数据估计恶性肿瘤组织中的间质和免疫细胞(ESTIMATION)是用于根据基因组计算肿瘤相关正常细胞在肿瘤组织中的浸润的创新算法。根据免疫和间质细胞中表达的特定分子生物标志物，计算免疫/间质分数来反映TME。然而，该算法在探索GBM微环境的文献中仍未得到广泛应用。

在从GlioVis转录组检索到的46例GBM病例中，亚型鉴定为经典型8例，间充质型例，神经型65例，前神经型0例。CIMP状态：G-CIMP33例，非G-CIMP例。

为了阐明分子表达模式与免疫/间质评分的关系，比较了GBM的4种转录组亚型(经典型、间充质型、神经型和前神经型)和CIMP状态(G-CIMP和非G-CIMP)的评分。免疫/间质评分与四种转录组亚型之间存在显著的相关性。间充质亚型的免疫/间质评分最高，而前神经亚型的评分最低(图A)。非G-CIMP组的免疫/间质评分显著高于G-CIMP组(图B)。

为探讨免疫/间质评分与GBM患者生存时间的关系，以免疫评分和间质评分的中位数为界值，将46例GBM患者分为低评分组和高评分组。采用Kaplan-Meier生存分析比较两组间的生存率。生存分析结果显示，免疫/间质评分升高的患者的中位总存活率比免疫/间质评分低的患者的结果低，但结果并不十分显著(图C，P=0.08；图D，P=0.06)。

这证明了免疫/基质评分与GBM亚型显着相关，得分较高与GBM患者的生存时间较短有关。我们还发现，IDH野生型肿瘤的转录亚型，除了被确定为神经亚型的以外，还可以差异地激活免疫微环境。与经典型和前神经型的GBM相比，间充质亚型GBM表现出更高比例的M巨噬细胞和嗜中性粒细胞，活化的自然杀伤细胞比例更低。同时，在前神经型GBM中，静息记忆CD4+T细胞的比例降低了（图SA）。

比较46名GBM患者分为高分组和低分组后的转录组数据，来揭示基因表达谱与免疫/基质评分之间的相关性。可以在生成的热图中观察到具有高免疫/间质评分的患者和具有低免疫/间质评分的患者的差异基因表达谱（图A，B）。

为了比较免疫评分组和基质评分组，基因表达谱分别显示P值0.05和

logFC

的8和80个差异表达的基因。此外，维恩图显示5个基因在基质/免疫评分组中差异表达（图C）。将重点放在这5个基因（称为与肿瘤环境相关的差异表达基因（DEGRTME）上，用于后续分析进行功能富集分析以阐明这5个基因的功能背后的机制。

图D-G中列出了基因本体论（GO）和KEGG的前0个功能注释。结果表明，DEGRTME与免疫相关的术语/途径密切相关，例如细胞外基质、中性粒细胞介导的免疫、体液免疫反应、炎症反应的调节、急性炎症反应、IgG结合、信号传导模式识别受体活性和补体和凝血级联。

通过最大似然生存模型和套索法筛选出4个基因(CLEC5A、SERPING、CHI3L和CR)构建TME相关模型。这四个基因在Gravendeel数据集和CGGA的另一个独立数据集中也被证实是差异表达的基因(图SB，C)。

通过回归系数和基因转录组数据得到每个患者的预后风险评分。在计算风险评分后，根据风险评分的最佳分界点将TCGAGBM患者分为高风险组和低风险组。图3A显示了四个基因签名风险分数的分布。图3B列出了两个风险组之间的GBM的生存状态和生存时间。值得注意的是，这四个基因在高风险组的表达明显高于低风险组(图3C)。此外，与低危组相比，高危组的总体生存时间更差(P0.)(图3D)。时间相关ROC曲线(AUC)下的面积显示，在训练集中，该模型的、3和5年总生存率分别为0.63、0.70和0.7(图3E)。

该模型在Gravendeel验证数据集中的性能与在训练集中的性能相同(图3F-I)。在验证组中，签名的、3和5年总存活率的AUC值分别为0.、0.和0.8(图3J)。

使用WGCNA的R包对训练集进行WGCNA后，构建共表达网络，阐明了这四个基因的机制。用模块特征基因(ME)来衡量基因模块与免疫/基质评分的相关性，该模块代表了所有基因在相应模块中的表达水平。产生了个基因模块，包含从50到个不同的基因。每个模块都标有随机颜色，这些模块分别包含、69、、8、4、、95、68、68、63、50、87、79、08、47、、48、83、95、和个基因。根据WGCNA开发者的基本原理，“灰色”模块被定义为一个非共表达的群体(图S3A-D)。

结果表明，*色和棕色模块中含有这4个基因，并筛选出了属于这两个模块的基因。基于这两个模块中包含的基因，构建了TME相关模型的共表达网络(图4A)。与CR、SERPING、CLEC5A和CHI3L共表达的基因分别为4、48、99和个。这个模型的共表达网络包含09个节点，由条边高度连接(图4A)。

GEPIA是一个用于分析肿瘤和正常样本的RNA测序表达数据的网络服务器，它显示这四个基因在GBM组织中的表达水平高于在非GBM组织中的表达水平(图4B-E)。

为了确定TME相关特征是否是GBM患者的独立预测因素，采用单变量和多变量Cox比例风险回归分析了年龄组(年轻人与老年人)、CIMP状态(非G-CIMP与G-CIMP)、MGMT状态(非甲基化与甲基化)、亚型(神经型+前神经型与间质型+经典型)和风险水平(低与高)的可能预测因素。在TCGAGBM数据集中，MGMT状态(HR=.39，P=0.07)、CIMP状态(HR=3.04，P=0.)、年龄组(HR=0.63，P=0.00)和风险水平(HR=0.53，P=0.)是独立的预测因素。在Gravendeel数据集(表)中，CIMP状态(HR=.09，P=0.0)、年龄组(HR=0.46，P=5.6×0?05)和危险程度(HR=0.64，P=0.05)是独立的预测因素。

当考虑风险水平和其他临床病理因素(年龄、CIMP状态、MGMT状态)的综合影响时，低风险组中年轻患者的中位生存期最长，而高危组中老年患者的中位生存期最短(图4F)。同样，携带非G-CIMP的高危组患者的中位生存期最短。相反，属于低风险组的G-CIMP患者的中位生存期最长(图4G)。

这一结果在验证数据集中得到了验证(图S3E，F)。

我们的模型也很好地对MGMT甲基化和非MGMT甲基化患者的中位生存期进行了分层(图4H)。

因此，这些结果表明，所建立的TME相关预后模型是一种独立的预后生物标志物，是GBM分层的有价值的标志物。

在使用训练集构建TME相关预测模型并使用验证集验证其效率之后，计算了该模型与GBM免疫细胞浸润的相关性(图5和图S4)。用皮尔逊相关分析生成散点图，并确定其统计学意义。风险评分和模型中识别的4个基因与树突状细胞(DC)浸润呈中度相关(图5A-E)。

CLEC5A与中性粒细胞、巨噬细胞和CD4+T细胞(图S4A)的浸润呈弱相关。SERPING与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的浸润呈弱相关(图S4B)。CHI3L与CD4+T细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的浸润呈弱相关(图S4C)。Cr与B细胞、CD+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的浸润呈弱相关(图S4D)。风险评分与CD4+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞的浸润显著相关(图S4E)。

这一结果表明，我们的模型系统解释了免疫细胞在GBMTME，特别是DC中的浸润。

为了研究TME相关基因在GBM组织中的表达，我们探索了常春藤胶质母细胞瘤图谱项目的RNA-SEQ数据集。这个网络服务器收集了不同部位的GBM样本，包括细胞瘤、坏死周围带、坏死周围的假性扁平细胞、细胞瘤中增生的血管和增殖的微血管样本。结果显示，GBM坏死区高表达TME相关基因（图5F）。

为了进一步证实这一点，我们研究了模型与周围坏死相关基因（例如CD44）之间的相关性，这些基因在缺氧条件下被激活并与HIF-α相互作用以调节周围坏死和血管周围神经胶质瘤细胞的缺氧表型。散点图显示属于TME相关模型的四个基因的表达与CD44和HIF-α（称为EPAS）具有很强的相关性（图5G-H）。

此外，单细胞聚类的结果表明，这四个基因在泛免疫标记物PTPCR(CD45)定义的三个最大免疫细胞簇或从肿瘤核心收集的肿瘤细胞中高度表达，肿瘤核心是发生坏死的位置（图S5A-C）。

免疫组织化学结果显示，与非坏死区和肿瘤周围组织相比，GBM坏死区中的CR和CHI3L高表达（图S6A，B）。

这些表明与TME相关的基因可能有助于坏死性GBM的低氧表型。

在这项研究中，我们通过整合TCGA数据和估计算法，根据免疫/间质评分来识别差异表达基因，分析了潜在的TME相关GBM患者的预后标志。筛选出共同的基因，然后采用稳健的基于可能性的生存模型来识别与GBMTME相关的预后基因。此外，我们使用套索方法构建了一个独立的预后模型，该模型包含4个在GBM中异常表达的基因，这些基因和模型与GBM患者的免疫浸润水平和缺氧表型显著相关。本研究结果将有助于阐明TME对GBM的影响，并为免疫治疗提供替代靶点。

Referencerognosticvalueandimmunecellinfiltrationofhypoxicphenotype-relatedgenesignaturesinglioblastomamicroenvironment

PMID：

DOI：0./jcmm.